水孔蛋白(aquaporin, AQP)指存在于质膜和细胞内膜上能高效转运水分子的膜内在蛋白，属于MIP (major intrinsic protein)超家族，分子质量在23~31 ku，它们广泛存在于微生物，植物和动物当中(Borgnia et al., 1999)。人们最早对于水孔蛋白感兴趣是因为它们的水通道活性，人们开始关注它们与植物水分吸收与利用率的关系(Schἅffner, 1998)。随着研究的深入，人们发现水孔蛋白不仅仅具有水通道的作用，它们能转运除水之外的多种物质，在植物的生长、发育、适应环境变化等方面，都有着重要的作用(Uehlein et al., 2003; Aroca et al., 2006; Forrest and Bhave, 2007; Li et al., 2009; Pang et al., 2010; Heckwolf et al., 2011)。因此，在广义上，所有的植物MIP蛋白都被称为水孔蛋白，而不仅仅特指具有水运输功能的MIP。植物水孔蛋白是由多基因家族编码，在拟南芥中有35个水孔蛋白基因，而在水稻和玉米中，有33个水孔蛋白基因(Chaumont et al., 2001; Johanson et al., 2001; Sakurai et al., 2005)。根据序列同源性和细胞定位，植物水孔蛋白一般被分为4个大类(Maurel et al., 2008)：质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)位于质膜上，而液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins, TIPs)处于液泡膜；第三类为类Nod26膜内在蛋白(nodulin 26-like intrinsic proteins, NIPs)，nod26是广泛存在于根瘤菌和豆科植物的共生膜上水孔蛋白，而NIPs也存在于非豆科植物中；定位于内质网的小分子碱性膜内在蛋白(small and basic intrinsic proteins, SIPs)。

植物PIPs包含两个子类，分别为PIP1和PIP2，主要区别在于N端和C端，它们都是由6个跨膜结构区构成，嵌入到细胞质膜中，参与细胞对外界水分的选择性运输，对于植物干旱胁迫和低温胁迫都有一定的作用(Li et al., 2008; Mahdieh et al., 2008; Matsumoto et al., 2009)。最近研究发现，PIPs能转运多种小分子物质，如甘油、H₂O₂和CO₂等，能够参与氮素，影响硅和硼等元素的代谢(Gaspar et al., 2003; Heckwolf et al., 2011)。水稻基因组已知编码13个PIPs基因，它们的时空表达特异性研究发现PIP各同源基因在不同组织中表达各不相同，而且胁迫诱导下也呈现出不同的表达模式(Sakurai et al., 2005)。同时，酵母中异源表达水稻PIP基因发现，PIP2亚家族比PIP1有更强的水通道活性，但是在玉米的PIP1和PIP2亚家族基因的研究中发现，PIP1与PIP2形成的异源四聚体与PIP2形成的同源四聚体相比，具有更高的透水性(Fetter et al., 2004)；水稻中也发现了这一现象，PIP1;3的异源表达，增加了PIP2蛋白的透水性，这说明PIP1和PIP2基因的表达和功能具有协同性(Matsumoto et al., 2009)。水稻PIP1亚家族有三个同源基因，分别为OsPIP1;1、OsPIP1;2和OsPIP1;3。Matsumoto等(2009)发现OsPIP1;3过表达转基因植株能增加水稻植株对于低温胁迫的抗性，而OsPIP1;1转基因植物不仅能增加抗盐胁迫的能力，而且其对转基因植株的影响具有剂量效应，适度的表达OsPIP1;1能够提高转基因水稻的产量和种子的发芽率(Liu et al., 2013)。

然而，目前针对OsPIP1;2研究并不十分深入，主要依靠酵母异源表达来分析其渗水能力，对于其在水稻中的表达研究仅局限在不同条件下表达量的测定，并没有在水稻中进行转基因功能研究。因此，本研究从水稻中克隆出了OsPIP1;2，将其连接到植物表达载体pCAMBIA1301，构建了35S启动子驱动的OsPIP1;2表达载体，并成功将其导入到农杆菌EHA105中。同时，为了更好的验证OsPIP1;2在水稻细胞中的功能和定位，为了更全面的了解OsPIP1;2蛋白的亚细胞定位情况，本研究将不同的荧光蛋白分别融合到OsPIP1;2的N端和C端，构建了两个亚细胞定位载体。以上载体的构建，为深入了解和研究OsPIP1;2在水稻中的功能打下了基础。

1结果与分析
1.1水稻OsPIP1;2的克隆与序列分析
以三叶期日本晴幼苗为材料，经液氮研磨后立即使用Tripure提取RNA。从图1可以看出，所提取的RNA的25S与18S条带清晰，亮度比约为2:1，说明所提RNA质量较好；Nanodrop紫外分光光度计测定其A_260:280=2.0，A_260:230≥1.8，说明所提RNA纯度较好。

图1 水稻日本晴幼苗总RNA的提取 Figure 1 RNA extraction of seedings for rice cultivar Nipponbare

由于水稻PIP有多个同源基因，其序列同源性很高，因此为了避免非特异性扩增，采取两轮巢式PCR方法，第一轮利用特异性引物扩增包含其编码区与部分非编码区的片段，第二轮以第一轮PCR为模板，利用内侧引物扩增其编码区序列，该序列从起始密码子至终止密码子(图2)。

 

图2 水稻OsPIP1;2的扩增 注: M1: DL5000 marker; A: 外侧引物第一轮扩增的结果; 1为扩增产物; M2: DL2000 marker; B: 内侧引物第二轮扩增的结果; 2为扩增产物 Figure 2 Amplification of OsPIP1;2 Note: M1: DL5000 marker; A: First round amplification using outer primer; 1: PCR product; M2: DL2000 marker; B: Second round amplification using inner primer; 2: PCR product

将克隆的带酶切位点的OsPIP1;2编码区序列连接到pMD19T-simple克隆载体上，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定(图3)，说明OsPIP1;2克隆成功，将克隆载体命名为PMD-PIP1;2。将PCR阳性克隆送测序，测序片段通过Blast在线分析，发现与已报道的OsPIP1;2序列一致(Sakurai et al., 2005)，说明序列克隆的成功。

图3 PMD-PIP1;2的菌液PCR鉴定 注: M: DL2000 marker; 1~3: PCR产物。 Figure 3 Strain liquid PCR of PMD-PIP1;2 Note: M: DL2000 marker; 1~3: PCR products

将OsPIP1;2翻译成蛋白质后，进行系统进化树分析(图4)，结果表明已克隆的OsPIP1;2与OsPIP1;1和OsPIP1;3亲缘关系最近，与玉米和拟南芥的相关PIP1蛋白亲缘关系较近，而与OsPIP2家族较远。而通过进化距离分析(表1)，拟南芥AtPIP1;2 (Heckwolf et al., 2011)在水稻中与OsPIP1家族的进化距离较近，其中与OsPIP1;2最近，为0.126。

 

图4 PIP蛋白系统进化树 注: 采用邻接法模型, bootstrap test=1 000 Figure 4 Phylogenetic tree of PIP proteins Note: Neighbor-joining (NJ) method, bootstrap test=1 000

表1 PIP基因进化距离分析 Table 1 Evolutionary distance analysis of PIPs

1.2 OsPIP1;2植物过表达载体的构建与农杆菌转化
通过利用双酶切PMD-PIP1;2与pCAMBIA1301 (图5)，将回收片段连接转化到大肠杆菌，挑取单克隆进行PCR鉴定并提取质粒进行双酶切验证(图6)，说明载体连接成功，将质粒送样测序，测序结果表明该载体构建成功，将此载体命名为P1301-PIP1;2。将提取的P1301-PIP1;2测定OD值，其OD_260/280=1.9。提取P1301-PIP1;2后，利用冻融法转化到农杆菌EH-A105中，通过农杆菌菌液PCR鉴定(图7)，说明成功的将质粒导入到农杆菌中，可以用作水稻遗传转化。

图5 P1301-PIP1;2的构建 注: A: P1301-PIP1;2载体构建流程; B: 目的片段与载体的双酶切; M: DL15000 marker; 1和2分别为pCAMBIA1301和PMD-PIP1;2经NcoⅠ与BstEⅡ双酶切产物 Figure 5 Vector construction of P1301-PIP1;2 Note: A: Protocol of vector construction of P1301-PIP1;2; B: Double-enzyme digestion of the target fragment and vector; M: DL15000 marker; 1: Product of pCAMBIA1301 digested with NcoⅠ and BstEⅡ; 2: Product of PMD-PIP1;2 digested with NcoⅠ and BstEⅡ

图6 P1301-PIP1;2重组质粒的鉴定 注: A: P1301-PIP1;2重组质粒的PCR鉴定; M1: DL2000 mar- ker; 1~3: PCR产物; B: P1301-PIP1;2重组质粒双酶切鉴定; M2: DL15000 marker; 4: NcoⅠ单酶切产物; 5: BstEⅡ单酶切产物; 6: NcoⅠ和BstEⅡ双酶切产物 Figure 6 Identification of recombinant plasmid of P1301-PIP1;2 Note: A: PCR of recombinant plasmid of P1301-PIP1;2; M1: DL- 2000 marker; 1~3: PCR products; B: Double-enzyme digestion of recombinant plasmid of P1301-PIP1;2; M2: DL15000 marker; 4:  Product of P1301-PIP1;2 digested with NcoⅠ; 5: Product of P1301-PIP1;2 digested with BstEⅡ; 6: Product of P1301-PIP1;2 digested with NcoⅠ and BstEⅡ

图7 P1301-PIP1;2转化农杆菌菌液PCR 注: M: DL2000 marker; 1~6为PCR产物 Figure 7 Strain liquid PCR of P1301-PIP1;2 with Agrobacterium tumefaciens Note: M: DL2000 marker; 1~6: PCR products

1.3 OsPIP1;2亚细胞定位载体的构建
为了更全面的了解目的蛋白的亚细胞定位情况(Simpson et al., 2000)，本研究将绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白(Shaner et al., 2008)分别融合到OsPIP1;2的N端和C端, 构建了两个亚细胞定位载体。C端载体为pBI121-GPF (绿色荧光蛋白载体)和N端载体为PXDR (红色荧光蛋白载体)，其中PXDR是一种新型表达载体，通过XcmⅠ酶切后可获得末端多出一个T残基的TA克隆载体，可以直接将PCR产物通过TA克隆连接到载体，而避免了繁琐的酶切位点的分析和选择，适合于高通量的基因功能研究(Chen et al., 2009)。本研究设计的引物带有保护碱基，其中反向引物的保护碱基为终止密码子TGA，在TA克隆连接到C端载体后，发挥终止密码子的作用，而通过酶切后能够消除终止密码子，保证其与N端载体的GFP蛋白融合表达，这样可以利用一次PCR的产物进行两个载体的构建(图8)。

图8 OsPIP1;2-SL 的扩增 注: A: OsPIP1;2-SL结构图, 粗体字符为起始密码子与终止密码子; B: OsPIP1;2-SL的电泳图; M: DL2000 marker; 1: PCR产物 Figure 8 Amplification of OsPIP1;2-SL Note: A: Structure of OsPIP1;2-SL; The initiation codon and termination codon are highlighted in bold type; B: Electrophoresis of OsPIP1;2-SL; M: DL2000 marker; 1: PCR product

pBI121-GPF与OsPIP1;2-SL的酶切产物连接进行后转化DH5a，挑取阳性克隆进行PCR鉴定(图9)，并将阳性克隆送测序，测序结果表明载体构建成功，将此载体命名为pGFP-OsPIP1;2-N。用XcmⅠ酶切PXDR后(图10)，将回收的载体片段与OsPIP1;2-SL进行连接后转化。由于PXDR酶切后产生相同的粘端，因此OsPIP1;2-SL有可能正向或反向插入到载体中，本研究利用OsPIP1;2-SL-F这条正向引物和Nos终止子引物进行PCR扩增(图11)，阳性克隆送样测序结果表明载体构建成功，将该载体命名为pRFP- PIP1;2-C。以上两个载体由于采用不同的荧光蛋白，因此可以进行共转化，在一个细胞内同时观察它们的细胞定位，不仅快速而且更有效的了解OsPIP1;2在细胞中的分布。

图9 pGFP-OsPIP1;2-N载体构建 注: A: pGFP-OsPIP1;2-N载体构建流程; B: pBI221-GFP载体双酶切; C: pGFP-OsPIP1;2-N菌液PCR结果; M: DL2000 marker; 1~4: PCR产物 Figure 9 Vector construction of pGFP-OsPIP1;2-N Note: A: Schematic diagram of vector construction of pGFP-OsPIP1;2-N; B: Double-enzyme digestion of pBI221-GFP; C: Strain liquid PCR of pGFP-OsPIP1;2-N; M: DL2000 marker; 1-4: PCR products

图10 pRFP-OsPIP1;2-C载体构建 注: A: pRFP-OsPIP1;2-C载体构建流程; B: PDXR酶切结果; M: DL5000 marker Figure 10 Vector construction of pRFP-OsPIP1;2-C Note: A: Schematic diagram of vector construction of pRFP-OsPIP1;2-C; B: PDXR digested by XcmⅠ; M: DL5000 marker

图11 pRFP-OsPIP1;2-C菌液PCR结果 注: M: DL2000 marker; 1~7: PCR产物 Figure 11 Strain liquid PCR of pRFP-OsPIP1;2-C Note: M: DL2000 marker; 1~7: PCR products

2讨论
OsPIP1;1的亚细胞定位发现其除了定位于质膜上，而且还存在与一些类内质网的细胞结构中(Liu et al., 2013)，因此OsPIP1;2亚细胞定位的分析对于发掘其未知的功能是很有意义的。绿色荧光蛋白及其衍生出的各种荧光蛋白被广泛应用于目的蛋白的亚细胞定位研究(Shaner et al., 2008)。之前的研究表明，不同的目的蛋白其定位信息可能在N端也可能在C端，甚至两端都有(Wang et al., 2003)，因此如果将荧光蛋白融合在目的基因N端，很可能导致信号肽无法被识别，反之亦然(Simpson et al., 2000)。为了更全面的了解OsPIP1;2蛋白的亚细胞定位情况， 将两种荧光蛋白与OsPIP1;2的N端和C端分别进行了融合，构建了两个不同的亚细胞定位载体，可以通过共转化同时进行观察。水稻PIP1亚家族在水稻低温胁迫应答中能够发挥重要的作用(Matsumoto et al., 2009)，而OsPIP1;1能够提高水稻抗旱能力和抗盐能力(Lian et al., 2004; Guo et al., 2006; Liu et al., 2013)。OsPIP1亚家族具有很高的同源性，它们的表达模式有所不同，但是它们的一级结构和渗水性都十分相似(Sakurai et al., 2005)，这些结果都为研究OsPIP1;2在水稻中的功能提供了很好的借鉴。之前对于OsPIP亚家族的研究主要关注其与水分相关胁迫之间的关系，最近，OsPIPs家族还发现能够提高水稻对重金属的耐受性(Mosa et al., 2012)。Liu等(2013)发现OsPIP1;1转基因水稻能够在一定程度上增加产量，而在水稻中异源表达大麦PIP2;1能最高增加40%的CO₂传导率(Katsuhara and Hanba, 2008)；然而，之前的研究表明异源表达系统对于某些PIP蛋白的活性的发挥具有很大的局限。进一步对已克隆的OsPIP1;2基因进行序列分析，结果表明其与拟南芥PIP1;2有很高的序列相似性，这是否暗示着二者在功能上具有相似性?最近，在模式植物拟南芥中对AtPIP1;2的研究发现其在CO₂运输与转运上具有重要的功能，它的过表达与干扰植株能够影响细胞CO₂吸收和光合速率，并从分子水平和细胞水平进行了详细的阐述(Heckwolf et al., 2011)。因此，水稻PIP蛋白功能的多样化与重要性使得对于OsPIP1;2在水稻中的功能更加让人期待，通过转基因技术将OsPIP1;2导入到现有水稻品种中，能够更快更精确的确定OsPIP1;2在水稻中的功能。本研究通过对OsPIP1;2过表达载体以及亚细胞定位定位的构建，为深入了解和研究OsPIP1;2在水稻中的功能提供了可能，也为深入挖掘其在水稻育种中的潜力打下了基础。

3材料与方法
3.1试剂与材料
水稻粳稻品种日本晴(Nipponbare)由本实验室提供。根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105，大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α由本实验室保存。质粒载体pMD19T-simple购于Ta-KaRa公司；pCAMBIA1301 载体由本实验室保存；pBI221-pGFP由遗传所王永红老师惠赠。DEPC购于Sigma公司；Tripure购于Roche 公司；T4连接酶，反转录试剂盒购于Fermantas公司；LA酶，DNA Marker (DL2000, DL5000和DL15000)购于TaKaRa公司；限制性内切酶购于NEB公司；质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒购于Promega公司。引物由上海生工生物技术有限公司合成；测序由Life Technologies公司完成。

3.2实验方法
3.2.1 OsPIP1;2编码区的扩增以及序列分析
利用Tripure试剂从水稻日本晴叶片中提取RNA，操作流程按照厂商说明书进行。根据NCBI注释的水稻OsPIP1;2 (GenBank登录号AK098849.1)序列设计 进行PCR扩增。经过两轮巢式PCR扩增特异性目的序列，第一轮引物上下游序列分别为5'-GAG- CGAGCGAAGCCAGCAGCAGAA-3'和5'-CTAACAAAGCAGGCAGCGGGAAAC-3'，第二轮引物上下游序列分别5'-GAGCCATGGAGGGGAAGGAGGAG-3' (下划线部分为NcoⅠ酶切位点, 粗体字符为起始密码子)和5'-CTGGGTCACCTTACGACCTGCTCTTGAATG-3' (下划线部分为BstEⅡ酶切位点, 粗体字符为终止密码子)；PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 5 min。将PCR产物通过TA克隆连接到pMD19T-simple克隆载体上，对重组克隆进行PCR鉴定，PCR条件参照上述克隆步骤，通过DNA测序确定序列是否正确。利用Blast在线比对和DNAMAN对测序结果进行序列分析，利用MEGA5.1软件(Tamura et al., 2011)分析进化距离和构建系统进化树。

3.2.2 过表达载体构建亚细胞定位载体构建
利用NcoⅠ和BstEⅡ双酶切pMD-PIP1;2与pC-AMBIA1301，分别回收PIP1;2片度与pCAMBIA-1301酶切片段，将载体片段与PIP1;2片段按摩尔比1:5在22度连接4 h后，用冻融法转化到DH5a感受态中，挑取重组克隆进行PCR和双酶切鉴定，PCR条件参照3.2.1。

3.2.3亚细胞定位载体构建
3.2.3.1用于细胞定位的插入片段的PCR扩增
设计带酶切位点的引物，上游引物PIP1;2-SL- F：5'-GTATCTAGATGGAGGGGAAGGAGG-3' (下划线部分为XbaⅠ酶切位点, 粗体字符为起始密码子)，下游引物PIP1;2-SL-R：5'-TCAAAGCTTCGACCTGCTCTTGAATGGA-3' (下划线部分为HindⅢ酶切位点，粗体字符为终止密码子)，以含有PIP1;2片段的克隆载体pMD-PIP1;2为模版，利用LA酶进行PCR扩增，PCR条件参照3.2.1，对PCR产物进行胶回收纯化，并将其命名为PIP1;2-SL。

3.2.3.2 pGFP-PIP1;2-N瞬时表达载体的构建
分别用XbaⅠ和HindⅢ双酶切将PIP1;2-SL与pBI221-GFP，将酶切产物进行乙醇纯化，将纯化产物按载体片段和插入片段摩尔比1:5在22度连接4 h后，用冻融法转化到DH5a感受态中，挑取重组克隆进行PCR鉴定，PCR引物与条件参照3.2.1。

3.2.3.3 pRFP-PIP1;2-C瞬时表达载体的构建
利用XcmⅠ对PXDR载体进行酶切，回收PXDR大片段，将回收片段与PIP1;2-SL在22度连接1 h后，用冻融法转化到DH5a感受态中，挑取重组克隆进行PCR鉴定，PCR条件参照3.2.1，PCR反应的上游引物PIP1;2-SL-F，下游引物为Nos-R：5'-GCGTATTAAATGTATAATTGCGGGACT-3'。

作者贡献
魏毅东和张扬是本研究的的执行人；魏毅东、许惠滨和张扬完成数据分析，论文初稿的写作；谢华安参与实验设计，试验结果分析；王宗华、张建福是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
 本研究由福建省财政专项(CXTD-1-1301)资助。

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